Fermentation von rekombinanten Proteasen in Pichia pastoris

Abstract

Das Ziel dieser Masterarbeit war die rekombinante Expression und Reinigung von
Proteasen in Pichia pastoris. Für die Fermentation wurde ein synthetisches Medium
untersucht, welches sowohl in Schüttelkolbenversuchen (20 – 100 mL) als auch im 2 L
Laborfermenter angewendet wurde. Zur Optimierung der Expression wurden die
Medienzusammensetzung (z.B.: verschiedene Kohlenstoff- und Stickstoffquellen,
Konzentration der Kohlenstoffquelle, Puffer) und die Fermentationsbedingungen (Dauer,
Induktionszeitpunkt, pH-Wert) variiert. Im Zuge der Schüttelkolbenversuche wurde
auch ein Klonscreening durchgeführt. Bei den Schüttelkolbenversuchen konnte eine
Expression der Protease S6 sowohl auf Glycerin als auch auf Sorbitol als
Kohlenstoffquelle, jeweils in Kombination mit einem Phosphatpuffer, über Western Blot
nachgewiesen. Im Fermentationsüberstand der Laborfermenter war die Expression der
Protease S6 ebenfalls mit beiden Kohlenstoffquellen im Batchmedium über Western Blot
nachweisbar, jedoch war das Wachstum auf Sorbitol wesentlich langsamer als auf
Glycerin. Für die Protease S4 wurden die optimierten Bedingungen von den
Fermentationen der Protease S6 übernommen. Für beide Proteasen wurden die
Fermentationsüberstände aus dem Laborfermenter mittels Cross-Flow Filtration
aufkonzentriert und dialysiert. Die anschließende Reinigung der His-getaggten
Proteasen erfolgte via Immobilisierter Metallionen-Affinitäts-chromatographie (IMAC)
und wurde für beide Proteasen erfolgreich durchgeführt. Die stufenweise Reinigung
wurde mittels SDS-PAGE, Western Blot und verschiedenen Aktivitätsassays überprüft.
Bei der Protease S6 kam es wiederholt zu einer Expression vor der eigentlichen
Induktion mit Methanol. Dieses Phänomen konnte durch eine lineare nested PCR in die
stromaufwärts gelegene Genomsequenz und anschließender Sequenzierung
wahrscheinlich darauf zurückgeführt werden, dass das Protease-Gen nicht am
natürlichen AOX1-Genlocus integriert ist. Die final erreichte spezifische Aktivität der
Protease S6 betrug 73 U/mg, die der Protease S4 5872 U/mg.

Datum der Bewilligung	2019
Originalsprache	Deutsch
Betreuer/-in	Agnes Grünfelder (Betreuer)